酵母单双杂注意事项

在生物研究领域，酵母单双杂交技术作为研究蛋白相互作用的重要手段，其操作中每个步骤都需仔细把控。以下是关于酵母单双杂交实验中关键注意事项的详细介绍：

质粒与菌株的选择

在双杂交实验中，我们采用pGADT7(AD)和pGBDT7(BD)质粒，以及AH109或Y2Hgold菌株。而在单杂交体系中，通常采用pHIS2质粒与pGADT7，结合Y187菌株，以适应不同的研究需求。对于特殊应用，如金担子素筛选，本文将略过，专注于基础操作的讲解。

双杂交操作步骤

首先，自激活与毒性检测至关重要。Bait基因通常在pGBKT7上构建，注意启动子可能存在的自激活效应，需相应处理。筛选过程中，从SD/-Leu-Trp平板挑选出良好生长的单克隆，然后在2x YPDA培养基中培养并离心，再将菌体接种于四缺平板，观察菌斑形成情况。

结果解读

通过对比平板上的菌斑，我们可以判断目的蛋白的性质。无明显菌斑表示毒性，SD-2与SD-4的对比则揭示自激活或无自激活情况。同时，通过设置对照组，更准确地评估实验结果。

单杂交操作详解

单杂交实验中，pHIS2载体与HIS3报告基因的结合是关键。使用Y187菌株以减少背景表达。转化过程与双杂交类似，但最后一步需将菌液滴在三缺培养基上，并加入3AT以筛选出真正的相互作用。

注意事项

在操作过程中，注意3AT浓度的梯度设置，它有助于区分真实互动和非真实背景。高浓度的3AT有助于排除假阳性，确保实验结果的准确性。 通过这些细致的操作步骤和注意事项，您可以确保酵母单双杂交实验的高效和准确，从而揭示出目标蛋白之间的潜在相互作用。