科普讲堂|谈谈Illumina mRNA测序文库构建过程

转录组测序已深入人心，但想要真正掌握其核心，就必须了解文库构建的每一个细节。今天，让我们一起探索Illumina测序世界中的神秘过程，揭示那些隐藏的知识点。

1. 精准提纯：Poly(A)抓取与分离

在复杂RNA混合物中，mRNA的独特之处在于其3'端的Poly(A)尾巴。通过Oligo(dT)磁珠与这一特征结合，我们能分离出目标mRNA，去除其他如ncRNA、rRNA和tRNA等杂质。紧接着，含镁试剂协助我们打断mRNA，准备进一步的步骤。

2. 双链cDNA的编织：逆转录与合成

逆转录酶和dNTPs的结合，如同魔法般将断裂的mRNA转化为cDNA单链。随后，DNA聚合酶进一步作用，形成双链cDNA。RNase H酶在这个过程中发挥关键作用，确保生成的是纯DNA链。

3. 终端修复与接头添加：精细化过程

末端修复与加“A”环节是文库构建中的精密步骤。T4 DNA polymerase和DNA polymerase I协同工作，而T4 PNK则确保5'端的磷酸化。之后，NEB的接头技术采用U连接环状结构，还需用USER Enzyme进行后续处理。

4. 文库筛选：确保质量与纯度

接头连接后，文库成分变得复杂，磁珠双筛技术在此时至关重要。通过精确控制磁珠的添加量，我们确保只有正确添加接头的片段得以保留，去除杂质。

5. PCR扩增与后续检测

PCR扩增阶段，我们加入index以区分不同的文库。扩增后再次磁珠纯化，确保产物的质量。最后，通过Qubit和2100 High Sensitivity DNA Chip的检测，我们确定文库产物的浓度和大小，为后续测序做好充分准备。

了解这些步骤，你将拥有一个透彻的Illumina mRNA测序文库构建知识框架。每一步都关乎数据的准确性和深度解读，让我们继续探索科学的奥秘吧！